1. Классификация тандемных повторов (ТП) в базах данных генома мыши (in silico, биоинформатика) и проверка полученных предсказаний о позициях ТП in situ с помощью флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Найдены хромосом специфичные варианты ТП.

Рис. 1. A - Распределение полей ТП получено в программе Mathemаtica 6.0. Каждый кружок - одно из полей из общего количества 941. Размер кружка отражает размер поля в логарифмической шкале. Цвета соответствуют семействам ТП. А1 - МиСат (красный);В2 - МаСат (голубой); С3 - TRPC-21A (светло оранжевый); С4 - мульти локусные ТП (ML, фиолетовый); С5 - одно локусные ТП (SL, желтый); С6 - ТП, которые есть только в базе данных WGS (whole genome shotgun database, темно оранжевый); D7,8 - основанные на транспозонах ТП (TE, зеленый). Ось Х - длина мономера до 2 тнп ; ось Y - содержание ГЦ пар (GC %) нормализованное к 1; ось Z- % гомологии между мономерами в одном поле. B - Флюресцентная гибридизация in situ (FISH) с пробой ТП TRPC-21A, длинная проба (1) и короткая проба (2) с сигналами, положенными на кариотип (3). Использовали метафазные пластины клеток костного мозга. Отмечены номера хромосом. Окраска DAPI (ДНК) - голубой, сигнал FISH - зеленый. Масштабный отрезок - 5 µm. Хромосомы, которые несут сигнал в соответствии с предсказаниями in silico отмечены галочками. На рис.1, А ТП TRPC-21A отмечен светло оранжевым цветом.

В WGS мыши идентифицировано около 200 групп предсказанных in silico тандемных повторов (ТП). Структуры типа HOR (повторы высшего порядка) найдены для многих ТП, что предполагает наличие их хромосом-специфичных вариантов. Пробы для трех представителей семейств сконструированы на основе мономеров. Все хромосомы, несущие ТП in silico, метятся и in situ, однако метятся и другие хромосомы из-за неполной сборки гетерохроматиновых районов в эталонном геноме. Длинная проба, основанная на варианте TRPC-21A с хромосомы 3, гибридизуется на концах хромосом 3 и 17. До сих пор не существовало хромосом-специфичных проб на основе тандемных повторов для цитогенетики мыши.

Используя полученные данные, предполагается картировать часть новых ТП, имея в виду найти хромосом-специфичное распределение. Хромосом-специфичность проб может быть усилена мультимеризацией, так как длинная проба оказалась успешной. Пробы будут усовершенствованы вплоть до коммерческого использования с помощью компании Бигль (Санкт-Петербург).

2. Недавно открыта транскрипция сателлитной ДНК (сатДНК, разновидность тандемных повторов). Мы показали, что сатДНК вовлечена в ассоциацию хромосомных территорий. Проникающая на соседнюю хромосомную территорию сатДНК до некоторой степени деконденсируется. Деконденсация сопровождается деметилированием и транскрипцией. При дифференцировке мышиных эмбриональных стволовых клеток E-14 и IOUD2 перицентромерная сатДНК попадает в хромоцентры только через несколько дней после начала индукции. Перемещение сатДНК сопровождается ее ассоциацией с белком гетерохроматина HP1a и транскрипцией с перицентромерных, но не центромерных, тандемных повторов (ТП). РНК транскрибируется с одной (прямой) цепи и полиаденилирована. Пробы, полученные с этой РНК как кДНК, гибридизуются со всеми хромосомами. В дифференцированных клетках транскрипты находятся исключительно в хромоцентрах, в стволовых же и в клетках в процессе дифференцировки транскрипты формируют 1-2 кластера вне хромоцентров. Используя хроматин иммуно-преципитацию (ChIP) и иммуно окрашивание, мы показали, что в индуцированных клетках перицентромерные ТП (сатДНК) взаимодействуют с р68 РНК-хеликазой, которая известна как белок, вовлеченный в регуляцию транскрипции и дифференцировку.

3. Нашли новый белок, мезоглеин, и клонировали его ген. Тело сцифоидной медузы Aurelia aurita состоит из 2 слоев - эпидермиса и гастродермы. Слои разделены толстой прослойкой внеклеточного матрикса - мезоглеей. У A. aurita мезоглея населена мезоглеальными клетками. Мажорный белок мезоглеи с мол.массай 47 кДа определили с помощью диск-электрофореза в денатурирующих условиях (SDS-PAGE). Клонировали и сиквенировали часть мРНК этого белка длиной 1421 н.п. Поиск гомологии по нуклеотидным и белковым последовательностям показал, что это новый белок. Компьютерно полученная белковая последовательность содержит 416 аа домен ZP (Zona pellucida) и домен Delta/Serrate/Lag-2 (DSL). Белок назвали мезоглеин. Мезоглеин экспрессируется только в мезоглеальных клетках взрослой медузы, как показал ПЦР на РНК из разных типов клеток. Мезоглеин является представителем ZP доменных белков для самого низшего из типов животных. Белок оказался не только структурным элементом мезоглеи медузы, но и входит в состав новой структуры - пластины контакта в ооците A. aurita.

Рис. 2. A - Последовательные стадии развитии ооцита (I-VII) окрашены антителами (АТ, разведение сыворотки 1:2000). Иммунофлюоресценция с АТ против мезоглеина (нижний ряд, красный) и окраска DAPI (нижний ряд, синий) с фазовым контрастом (верхний ряд). Видно, что материал формирующейся пластинки контакта содержит те же антигенные детерминанты, что мезоглеин. Стрелки указывают на гранулы-предшественники. Масшт. отрезок- 10 µm. B - На диаграмме показаны стадии созревания ооцита A. аurita, адаптировано из Eckelbarger and Larson, 1988. Стадии созревания ооцита обозначены римскими цифрами в соответствии с собственной классификацией (Адонин и др., 2009) и арабскими в соответствии с исходной статьей: (1) ооцит начинает движение вглубь мезоглеи из герминативного эпителия; (2) клетки герминативного эпителия начинают превращаться в трофоциты, а в ооците формируются параллельные мембраны, напоминающие гладкий эндоплазматический ретикулум; (3) ооцит целиком погружен в мезоглею, но сохраняет контакт с трофоцитами; зародышевый пузырек (ядро) мигрирует ближе к трофоцитам и начинается синтез желтка; (4) желток формируется в комплексе Гольджи; (5) поздний вителогенный ооцит с большим количеством желтка. Иммунореактивные гранулы и пластина контакта добавлены к схеме. Поток морской воды, т.е. направление, откуда появится сперматозоид, отмечено стрелкой и очевидно, что пластина контакта экспонирована в этом направлении.

---

4. Иглокожие - вторичноротые животные, которые рано отделились от ветви, ведущей к млекопитающим. Положение на филогенетическом дереве, доступность и свободное развитие в морской воде, сделало иглокожих, особенно морских ежей, модельными объектами для решения многих ключевых вопросов биологии развития, биохимии, клеточной и молекулярной биологии, эволюционной биологии (Kondo et al., 2012).

Морские ежи семейства Strongylocentrotidae особенно популярны. Их обилие, большой размер и легкость содержания в лабораторных условиях, привели к тому, что они стали объектом многих ранних работ по биологии развития (Gustafson and Wolpert, 1964; Monroy and Maggio, 1964; Neyfakh, 1971).

В 2006 году опубликован геном Strongylocentrotus purpuratus, известного как "пурпурный морской еж" (Sea Urchin Genome Sequencing Consortium). Это один из немногих хорошо аннотированных геномов иглокожих.

Мы воспользовались преимуществами прочитанного генома Strongylocentrotus purpuratus для того, чтобы выявить транспозоны (TE, Transposable Element) и проверить наличие некоторых из них в геноме S. intermedius - дальневосточного серого морского ежа. Работа представляет собой необходимый подготовительный этап, чтобы использовать подобранные и проверенные праймеры для изучения транскрипции соответствующих ТЕ в развитии серого морского ежа.

Расхождение видов морских ежей произошло около 10 млн лет назад (Youn-Ho Lee, 2000). Мы использовали известные TE S. purpuratus, содержащиеся в базе данных повторов RepBase для расчета праймеров и выявления соответствующих ТЕ в транскриптоме S. intermedius.

С помощью геномного ассемблера SPADES (с параметрами по умолчанию) собрали из ридов транскриптома серого морского ежа, картированных на соответствующий мобильный элемент пурпурного морского ежа последовательности первых (по представленности) 100 мобильных элементов (см.: Табл.1). В таблице также представлены подобранные к последовательностям ТЕ праймеры и результаты ПЦР-анализа.

При ПЦР анализе мы получили продукт расчетной длинны в 92 случаях (из 100). Таким образом, результаты работы подтверждают оправданность использованного подхода. Экспериментальная работа с праймерами, сконструированными на основе ТЕ пурпурного ежа для идентификации ТЕ серого морского ежа, привела бы к неверным результатам: отсутствие транскрипции было бы артефактно основано на несходстве последовательностей. Проверенные и давшие положительный результат 92 из 100 собранных последовательностей ТЕ серого морского ежа безусловно пригодны для дальнейшей работы. Восемь пар праймеров, которые не дали ампликона расчетной массы или же дали набор продуктов (шмер), рассчитаны для последовательностей, количество ридов которых в транскриптоме невелико, что повлекло за собой ошибки сборки. Мы надеемся исправить эти ошибки после сборки прочитанного генома серого морского ежа.

Работа группы поддержана грантами РФФИ и грантом Президиума Академии наук "Молекулярная и клеточная биология"