Работа была поддержана российскими грантами: РФФИ и РАН "Молекулярная и клеточная биология"; международными грантами ESF, NCI NIH, INTAS, CRDF, а также грантами для молодых ученых.

в.н.с., к.б.н. Т.В. Поспелова
с.н.с., к.б.н. А.Н. Кукушкин
с.н.с., к.б,н. С.Б. Светликова
н.с., к.б.н. М.В. Абрамова
н.с., к.б.н. Т.В. Быкова
н.с., к.б.н. С.Г. Зубова
н.с., к.б.н. А.Б. Малашичева
м.н.с., к.б.н. А.И. Бричкина
м.н.с., к.б.н. А.М. Нелюдова
м.н.с. М.С. Лянгузова
м.н.с. И.А. Чуйкин
ст. лаб-иссл. Л.А. Супанько

Аспиранты: А.А. Бардин, В.С. Романов;
Студенты: Ф.П. Никуленков, Ж.В. Шитикова, Ю.Г. Зубова, И.А. Мельн, Г.С. Синева, Е.А. Затуловский, О.А. Анциферова

• Лаборатория проф. Peter Herrlich, Институт токсикологии и генетики (Карлсруе) и Институт молекулярной биотехнологии (сейчас Институт геронтологии), Иена, Германия
• Лаборатория проф. Alfred Nordheim, Институт клеточной биологии, Университет Тюбингена, Германия
• Лаборатория проф. Albert J. Fornace, Национальный Институт рака, Национального Института здоровья, Бетезда, и Институт Здоровья Гарвардского университета, США
• Лаборатория проф. Alex van der Eb, отдел молекулярного канцерогенеза, Лейденский университет, Нидерланды.

• Изучение механизмов автономной пролиферации и регуляции клеточного цикла в клетках эмбриональных тератокарциномных (ЭКК) и в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) мыши.

  Эмбриональные стволовые клетки имеют высокую скорость пролиферации, короткий клеточный цикл (около 10 ч) и не нуждаются в ростовых факторах сыворотки для пролиферации in vitro. Нами было показано, что, в отличие от других соматических клеток, ЭКК и ЭСК не останавливаются в клеточном цикле при удалении сывороточных ростовых факторов, при действии ДНК-повреждающих и стресс-факторов, но затем погибают по механизму программированной гибели (апоптоз). Хотя ЭСК экспрессируют важный регулятор клеточного цикла белок р53 дикого типа, уровень экспрессии гена-мишени - ингибитора активности циклин-киназных комплексов p21/Waf1 крайне низок и почти не увеличивается при действии ДНК-повреждающих агентов и стресс-факторов. Таким образом, в этих клетках не функционирует р53/Waf1-зависимый тумор-супрессорный путь, вызывающий блок клеточного цикла для коррекции генетических повреждений. Несмотря на отсутствие блока клеточного цикла G1/S и G2/M, ЭСК сохраняют стабильность генома и способность к дифференцировке благодаря тому, что клетки с генетическими повреждениями погибают апоптозом.

  Проводятся исследования роли Wnt/β-катенин и PI3K-зависимого сигнальных путей в поддержании высокопролиферативного статуса эмбриональных стволовых клеток мыши. Было показано, что в недифференцированных ЭСК мыши β-катенин локализуется в области межклеточных контактов и отсутствует в ядрах клеток, в то время как дифференцировка приводит к накоплению β-катенина в ядре. Подавление активности киназы GSK3β - медиатора Wnt/β-катенин-сигнального пути, препятствует приросту популяции ЭСК, вызывая гибель клеток, но не блок клеточного цикла.

  Подавление активности МАР-киназных каскадов не приводит к снижению пролиферативной активности ЭСК. Однако, ингибирование PI3K каскада вызывает снижение активности циклин-киназных комплексов и вызывает блок G1/S, который приводит не к дифференцировке или старению клеток, а к апоптозу. Блок клеточного цикла, индуцированный ингибиторами деацетилаз гистонов, также способствует апоптотической гибели. Таким образом, ЭСК мыши коммитированы на ускоренную пролиферацию и любое воздействие, приводящее даже к временной остановке, идентифицируется как генетическое повреждение, что индуцирует программу апоптоза.

  1. V.A. Pospelov, T.V. Pospelova, J.P. Julien. (1994). AP-1 and Krox-24 transcription factors activate the NF-L gene promoter in P19 embryonal teratocarcinoma cells. Cell Growth and Differ. 5: 187-196.

  2. Е.И.Орловская, Т.В.Кислякова, К.А.Осипов, А.Б.Малашичева, В.А.Поспелов. (1997). Функциональное состояние гена р53 в клетках эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9. Молек.биология, 31: 224-231.

  3. А.Б. Малашичева., Кислякова Т.В., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А. (2000). Отсутствие блока G1/S в клетках тератокарциномы F9 обусловлено деградацией ингибитора циклин-зависимых киназ p21^waf1/cip1. Цитология, 42(5): 433-440.

  4. A.B. Malashicheva., Kislyakova T.V., Aksenov N.D., Osipov K.A., Pospelov V.A. (2000). F9 embryonal carcinoma cells fail to stop at G1/S after γ-irradiation due to p21^waf1/cip1 degradation. Oncogene, 19: 3858-3865.

  5. А.Б.Малашичева, Т.В.Кислякова, П.Саватьер, В.А.Поспелов. (2002). Эмбриональные стволовые клетки не останавливаются в клеточном цикле при действии повреждающих факторов. Цитология. 44(7): 643-647

  6. P.Savatier, Malashicheva A.B. Cell cycle Control in Ebryonic Stem Cells. (2004). Handbook of Stem Cells. Vol.1 .Embryonic Stem Cells: 53-62, Elsevier, Academic Press.

  7. A.B. Malashicheva et al. (2006). LIF regulates the Activity of Cyclin-Dependent Kinases in mouse ES cells. Oncogene (in press).

  8. И. А. Чуйкин, М. С. Лянгузова, В. А. Поспелов. (2006). Пролиферация эмбриональных стволовых клеток мыши не связана с ядерной локализацией β-катенина. Доклады Академии наук (в печати).

• Молекулярные механизмы трансформации клеток млекопитающих вирусными и клеточными онкогенами
  (Группа молекулярных механизмов канцерогенеза - Т.В. Поспелова).

  Для изучения молекулярных механизмов канцерогенеза в лаборатории получена коллекция стабильных иммортализованных и трансформированных линий путем переноса вирусных (Е1А, Е1В) и клеточных онкогенов (сHa-Ras) в эмбриональные фибробласты грызунов дикого типа и с нокаутами по генам, контролирующим клеточный цикл: p53, p21^Waf1, p16/p19, стресс-киназам р38 и JNK. Показано, что процесс трансформации связан с нарушением работы программ, контролирующих клеточный цикл, апоптоз и ускоренное старение. Установлено, что вирусные онкогены осуществляют трансформирующее действие, нарушая работу негативных регуляторов клеточного цикла - тумор-супрессорных белков р53 и pRb, а также ингибитора циклин-зависимых киназ p21^Waf1, образуя с ним комплексы, приводящие к его функциональной инактивации. Клетки, трансформированные онкогенами E1A и Ras, характеризуются автономной пролиферацией, обусловленной конститутивной активацией MAP-киназных каскадов, нерегулируемой активностью транскрипционных факторов АР-1 и NF-kB и сменой состава транскрипционных комплексов (Fos/Jun → Jun/ATF2). Трансформанты обладают высокой и нерегулируемой активностью циклин-киназных комплексов, не способны реализовать блоки G1/S и G2/M клеточного цикла и блок в митотической контрольной точке после действия ДНК-повреждающих и стресс-факторов, и погибают апоптозом. Однако при действии модификаторов хроматина, типа ингибиторов гистоновых деацетилаз они сохраняют способность реактивировать программу ускоренного старения, приводящую к подавлению пролиферации за счет блока клеточного цикла на границе фаз G1/S. Использование трансформантов E1A+cHa-ras, полученных из эмбриональных фибробластов мыши с нокаутом по ингибиторам циклин-зависимых киназ р21/Waf1 и р16/Ink4а показало, что отсутствие циклин-киназных ингибиторов не влияет на формирование кратковременных, обратимых блоков клеточного цикла после действия ингибиторов гистон-деацетилаз, однако процесс ускоренного старения в них не активируется. При этом, нокаут по стресс-киназе р38а, отвечающей за старение в клетках человека, не препятствует программе старения (SA-bGal) и реализации необратимого блока клеточного цикла при длительной обработке гистон-деацетилазными ингибиторами. В устойчивых к апоптозу E1A+cHa-ras трансформантах, экспрессирующих ген человека Bcl-2, программу старения можно реактивировать действием цитостатика интеркалятора адримицина. Долговременные необратимые блоки G1/S в этом случае не связаны с падением циклин-киназной активности и изменением активности МАР-киназ. Антипролиферативное действие Bcl-2 в адриамицин-обработанных E1A+cHa-ras линиях, возможно только в присутствие стресс-киназы р38а, как это следует из данных по трансформантам с нокаутом по р38а.

  1. Д.В. Булавин, Ю.К. Кураш, Н.Д. Аксенов, В.А. Поспелов, Т.В. Поспелова. (1998). Функционирование р53/Rb-зависимого тумор-супрессорного пути в клетках REF, трансформированных онкогенами Е1А + сHa-ras, после действия ДНК-повреждающих агентов. Молек. Биол., 32:703-711.

  2. Д.Б. Булавин, В.А. Поспелов, Т.В. Поспелова.(1999). Онкобелки E1Aad5 способны ассоциировать с универсальным ингибитором циклин-зависимых киназ р21/Waf1 и подавлять его действие в трансформантах E1A+cHa-ras. Молек. Биол., 33: 641-643.

  3. T.V. Pospelova, A.V. Medvedev, A.N. Kukushkin, S.B. Svetlikova, A.J. van der Eb, J.C. Dorsman, V.A. Pospelov. (1999). E1A+cHa-ras transformed rat embryo fibroblast cells are characterized by high and constitutive DNA binding activities of AP-1 dimers with significantly altered composition. Gene Expression, 8: 19-32.

  4. D.V. Bulavin, N.D. Tararova, N.D. Aksenov, V.A. Pospelov, T.V. Pospelova. (1999). Deregulation of p53/Rb pathway does contribute to polyploidy and apoptosis of E1A+cHa-ras transformed cells after γ-irradiation. Oncogene, 18: 5611-5619.

  5. I.S. Smirnova, Yakovleva TK, Rosanov YM, Aksenov ND, Pospelova TV. (2001). Analysis of p53-dependent mechanisms in the maintenance of genetic stability in diploid tumourigenic line SK-UT-1B of human uterine leiomyosarcoma. Cell Biol Int. 25(11):1101-15.

  6. A.F. Are, Galkin VE, Pospelova TV, Pinaev GP. (2000). The p65/RelA subunit of NF-kappaB interacts with actin-containing structures. Exp Cell Res. 256(2):533-44.

  7. О.В. Тимофеев, В.А. Поспелов. (2003). Ингибитор циклин-зависимых киназ p21/Waf1: взаимодействие in vivo с онкобелками Е1А аденовирусов 2-го и 12-го типов. Цитология. 45(11): 1109-1127.

  8. A.R. Goloudina, H. Yamaguchi, D.B. Chervyakova, E. Appela, A.J. Fornace Jr, D.V. Bulavin. (2003). Regulation of human Cdc25A stability by Serine 75 phosphorylation is not sufficient to activate S-phase checkpoint. Cell Cycle. 2(5): 473-478.

  7. A.M. Nelioudova, N.D. Tararova, N.D. Aksenov, V.A. Pospelov, T.V. Pospelova. (2004). Restoration of G1/S arrest in E1A+cHa-ras-transformed cells by Bcl-2 overexpression. Сell Cycle, 3(11): 1427-1432.

  8. О.В. Тимофеев, Т.В. Поспелова, В.А. Поспелов. (2004). Функции p21^Waf1 в норме и при стресссовых воздействиях. Молек. биол. 2004, 38(3): 309-323.

  9. O.V. Timofeev, Lee T.Y., Bulavin D.V. (2005). A subtle change in p38 MAPK activity is sufficient to suppress in vivo tumorigenesis. Cell Cycle 4(1): 118-120.

• Структурные преобразования хроматина и регуляция экспрессии генов.

  Изучение структурной организации нуклеосомной фибриллы в хроматине показало, что некоторые нуклеазы (ДНК-за 1 и ДНК-за II) выявляют, так называемую, динуклеосомную периодичность фрагментации ДНК. Эта периодичность отражает специфику укладки нуклеосом в компактном (неактивном) хроматине, полученном из спермиев морских беспозвоночных и ядерных эритроцитов птиц, имеющих протяженную линкерную ДНК. В более активном хроматине из нейронов мозга птиц динуклеосомная периодичность фрагментации ДНК не обнаруживается, что коррелирует с более короткой линкерной ДНК. Более того, при анализе индивидуальных потенциально-активных и неактивных генов в хроматине эритроцитов птиц было показано, что "активный" бета-глобиновый локус фрагментируется ДНК-зой II с периодичностью 100 н.п., тогда как неактивный овальбуминовый локус имеет динуклеосомную периодичность расщепления. При понижении ионной силы в ядре характер фрагментации обоих локусов не отличается, т.е. доступностью к нуклеазе и тип фрагментации коррелирует со степенью компактизации хроматина. Анализ распределения нуклеосом по дочерним цепям ДНК при репликации хроматина позволил установить, что нуклеосомы распределяются равномерно по дочерним цепям ДНК.

  Процесс онкогенной трансформации сопровождается изменениями экспрессии позитивных и негативных регуляторов клеточного цикла. Нами было установлено, что в трансформантах E1A+Ras транскрипция некоторых генов раннего ответа, как протоонкоген c-fos, репрессирована и почти не активируется при стимуляции клеток ростовыми факторами сыворотки. Анализ механизмов репрессии позволил установить, что в области элемента SRE/AP-1 промотора гена c-fos происходит формирование компактной структуры нуклеосомы, вызванное рекрутированием гистон-деацетилазной (HDAC) активности и соответственно деацетилированием гистонов. Ингибиторы гистон-деацетилазной активности ацетилирование гистонов, декомпактизацию нуклеосомы и активацию транскрипции c-fos и других генов раннего ответа.

  Некоторые стресс-факторы как анизомицин, которые стимулируют стресс-киназы JNK и р38, также способны активировать транскрипцию гена c-fos в клетках, трансформированных онкогенами E1A и Ras. Однако последующие эксперименты показали, что активация транскрипции гена c-fos обусловлена повышением активности MEK/ERK киназного каскада (а не JNK и р38) и не сопровождается ацетилированием гистонов, т.е. идет по HDAC-независимому пути. Мы показали, что анизомицин стимулирует формирование окисленных форм кислорода (ROS) и что перекись кислорода как источник ROS обладает таким же действием, как и анизомицин. Мы предполагаем существование альтернативного механизма активации транскрипции генов, не связанного с ацетилированием/деацетилированием гистонов.

  1. H.T. Khachatrian, V.A. Pospelov, S.B. Svetlikova, V.I. Vorob'ev. (1981). Nucleodisome - a new repeating unit of chromatin revealed in nuclei of pigeon erythrocytes by DNAseI digestion. FEBS Letters. 128: 90-92.

  2. V.A. Pospelov, G. Rusev, L. Vasilev, R. Tsanev. (1982). Nucleosome segregation in chromatin replicated in the presence of cycloheximide. J Mol Biol. (Engl). 156: 79-92.

  3. V.A. Pospelov, B. Anachkova, G. Rusev. (1982). Organization of the newly replicated chromatin in the vicinity of the replication fork. Biochim. Biophys. Acta. 699: 241-246.

  4. V.A. Pospelov, H.G. Klobeck, H.G. Zachau. (1984). Correlation between DNAse I hypersensitive sites and putative regulatory sequences in human immunoglobulin genes of the k-light chain type. Nucleic Acids Res. 12: 7007-7021.

  5. A.N. Kukushkin, S.B. Svetlikova, V.A. Pospelov. (1988). A structure of potentially active and inactive genes of chicken erythrocyte chromatin upon decondensation. Nucleic Acids Res. 16: 8555-8569.

  6. A.N. Kukushkin, Abramova M.V., Svetlikova S.B., Darieva Z.A., Pospelova T.V. and Pospelov V.A. (2002). Downregulation of c-fos gene in E1A+cHa-ras-transformed cells is mediated through constitutive activation of MAP kinase cascades and recruitment of histone de-acetylase activity. Oncogene. 21: 719-730.

  7. M.V. Abramova, A.N. Kukushkin, S.B. Svetlikova, V.A. Pospelov. (2003). Selective repression of c-fos gene transcription in rat embryo fibroblasts transformed by oncogenes E1A and cHa-ras. Biochem.Biophys.Res.Comm. 306: 483-487.

  8. TN Usenko, AN Kukushkin, TV Pospelova, VA Pospelov. (2003). Downregulation of c-fos gene revealed in the established E1A+cHa-ras-transformed cells can be reproduced upon transient transfection of E1A and Ras oncogenes into non-transformed REF52 cells. Oncogene. 22(48): 7661-7667.

  9. А.Н.Кукушкин, Светликова С.Б., Поспелов В.А. (2005). Изучение активации генов раннего ответа c-fos, c-jun, Egr-1 в клетках, трансформированных онкогенами E1A и cHa-ras, при действии анизомицина. Молек. биол. 39(1): 80-88.

  10. А.N. Kukushkin, S.B. Svetlikova, R.A. Amanzholov, V.A. Pospelov. (2006). Anisomycin abrogates repression of c-fos transcription in E1A + cHa-ras transformed cells activating MEK/ERK kinase cascade. FEBS Letters (in press).

• Эпигенетические механизмы регуляции активности генов: антипролиферативное действие ингибиторов гистон-деацетилаз.

  Многие типы трансформированных и опухолевых клеток не способны реализовать блоки клеточного цикла G1/S и G2M при действии традиционных противоопухолевых агентов, что снижает возможности использования этих препаратов для подавления роста опухолей. Поскольку невозможность индукции блока клеточного цикла часто связана с нарушениями функционирования тумор-супрессорных путей (например, p53/Rb/Waf1 пути), большое значение приобретает изучение таких агентов, которые способны подавлять рост опухолевых клеток с явными дефектами функции тумор-супрессоров. В нашей лаборатории проводится исследование анти-пролиферативного действия ингибиторов гистон-деацетилазной (HDAC) активности. Ингибиторы HDAC стимулируют ре-ацетилирование нуклеосомных гистонов и тем самым вызывают преобразование (ремоделинг) структуры хроматина в тех участках генов, в которых имела место HDAC-зависимая репрессия генов, в частности, контролирующих клеточный цикл. Проведенные эксперименты показали, что ингибиторы HDAC, не изменяя экспрессии р53, вызывают в трансформантах E1A+cHa-ras активацию транскрипции гена, кодирующего ингибитор активности циклин-киназных комплексов p21^Waf1, и соответственно подавление активности циклин-киназных комплексов. Кроме того, ингибиторы HDAC подавляют экспрессию ряда позитивных регуляторов клеточного цикла - циклинов D1, E, A, c-myc, cdc25A. Соответственно, в трансформантах E1A+cHa-ras происходит блок G1/S клеточного цикла, но не происходит индукции апоптоза.

  Для того, чтобы выяснить молекулярные механизмы анти-пролиферативного действия ингибиторов HDAC мы получили трансформированные клеточные линии из эмбриональных фибробластов мыши с нокаутом по генам p21^Waf1 и р16^Ink4a/р19^Arf. Выяснилось, что клетки p21^Waf1-/-, трансформированные онкогенами E1A и Ras, почти в такой же степени способны претерпевать блок клеточного цикла при действии ингибиторов HDAC, как и клетки, экспрессирующие p21^Waf1. Таким образом, анти-пролиферативное действие ингибиторов HDAC может быть опосредовано через Waf1-независимые пути. Мы обратили внимание, что ингибитор HDAC (бутират натрия) подавляет активность ключевого регулятора перехода G1/S - транскрипционного фактора E2F в обоих типах клеток. Таким образом, анти-пролиферативное действие ингибиторов HDAC может быть связано с подавлением активности E2F.

  Мы также выяснили, что ингибиторы HDAC влияют на экспрессию важных компонентов, отвечающих за межклеточные взаимодействия (адгезию) и Wnt-сигналльный путь. В частности, бутират натрия вызывает накопление ключевого компонента Wnt-сигнального пути - бета-катерина, который вместе с кадгеринами участвует в адгезионной функции клетки, а вместе с факторами семейства Lef/Tcf осуществляет транскрипционную функцию. Мы предполагаем, что антипролиферативное действие ингибиторов HDAC может осуществляться через модуляцию активности кадгерин/бета-катенинового сигнального пути.

  1. М.В. Абрамова, С.Б. Светликова, Н.Д. Аксенов, Т.В. Поспелова, В.А. Поспелов. (2003). Ингибитор деацетилаз гистонов останавливает пролиферацию клеток, трансформированных онкогенами E1A и cHa-Ras. Цитология. 45(11): 1100-1107.

  2. Ю.Г. Зубова, Т.В. Быкова, С.Г. Зубова, М.В. Абрамова, Н.Д. Аксенов, В.А. Поспелов, Т.В. Поспелова. (2005). Индукция программы ускоренного старения ингибитором гистон-деацетилаз бутиратом натрия в нормальных и трансформированных фибробластах крысы. Цитология 47(12): 1055-1062.

  3. Чуйкин И.А., Лянгузова М.С., Поспелов В.А. (2006). Механизмы антипролиферативного действия ингибиторов гистон-деацетилазной активности на эмбриональные стволовые клетки мыши. Цитология (в печати).

  4. M.V. Abramova, T.V. Pospelova, F.P. Nikulenkov, C. Hollander, A.J. Fornace Jr., V.P. Pospelov. (2006). G1/S arrest induced by HDAC inhibitor sodium butyrate in E1A+Ras transformed cells is mediated through down-regulation of E2F activity and stabilization of β-catenin. J. Biol.Chem. (submitted).