Во-первых, была создана оригинальная программа для выявления стереоспецифических аномалий (СА) в структуре эукариотической ДНК. Под СА мы подразумеваем, участки ДНК, на проекции которых определенные сочетания нуклеотидов (обычно рассматриваются определенные динуклеотиды) повторяются неслучайно, например, так, что круг, изображающий последовательные витки ДНК, содержит секторы достоверно обогащенные и (или) достоверно обедненные определенным динуклеотидом. Мы показали, что расположение СА часто совпадает с регуляторными зонами или же с межгенными промежутками в ДНК, а также с локализацией некоторых центромеро-подобных элементов, и таким образом подобные СА могут служить индикатором расположения ДНК-белковых комплексов. Было показано, что СА встречаются при значениях шага спирали ДНК, перекрывающих значения, характерные как для A-, B-, так и Z-ДНК (от 10.0 до 12.3 нуклеотидов). Мы нашли, что СА, выявляемые нашими методами, по размерам больше, чем можно было бы предполагать, исходя из современных воззрений на ДНК-белковое узнавание. В связи с этим нами была выдвинута гипотеза о наличии в молекуле ДНК серии сайтов с малым сродством к взаимодействующим с ней белкам, расположенных около канонических нуклеотидных последовательностей, узнаваемых регуляторными белками. Наличие этих дополнительных сайтов, по выдвинутой нами гипотезе, обеспечивает увеличение локальной концентрации регуляторных белков около функциональных сайтов узнавания.

Во-первых, была создана оригинальная программа для выявления стереоспецифических аномалий (СА) в структуре эукариотической ДНК. Под СА мы подразумеваем, участки ДНК, на проекции которых определенные сочетания нуклеотидов (обычно рассматриваются определенные динуклеотиды) повторяются неслучайно, например, так, что круг, изображающий последовательные витки ДНК, содержит секторы достоверно обогащенные и (или) достоверно обедненные определенным динуклеотидом. Мы показали, что расположение СА часто совпадает с регуляторными зонами или же с межгенными промежутками в ДНК, а также с локализацией некоторых центромеро-подобных элементов, и таким образом подобные СА могут служить индикатором расположения ДНК-белковых комплексов.

Нами исследовался полностью секвенированный геном дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Было показано, что мощные стереоспецифические аномалии выделяют хромосомные районы с особым режимом экспрессии (и/или мобильности. В ряде случаев мы нашли цепочки разных СА. В некоторых, но не всех, исследуемых хромосомах, присутствуют особо крупные стереоспецифические аномалии, связанные с наличием системы коротких (около 100 нуклеотидов) повторов. Мы анализировали также более 10 миллионов пар оснований из нуклеотидной последовательности 21 хромосомы человека. Также последовательность человеческой альфа-сателлитной ДНК оказалась почти полностью покрыта крупными СА. Многочисленные очень крупные аномалии были найдены в ДНК других хромосом человека, и в хромосомах дрозофилы и нематоды. При филогенетическом сравнений СА в гомологичных участках ДНК разных организмов было показано, что консервативным является один из динуклеотидов, вовлеченных в СА, а также соответствующий шаг спирали.

Во-вторых, мы обнаружили уникальное явление: скрытый гетерокариоз в штаммах дрожжей-сахаромицетов, и изучили его в модельных экспериментах. В скрещиваниях с тестерными штаммами, несущими мутацию kar1, замедляющую кариогамию после слияния клеток, были получены клоны, проявляющие ядерные признаки одного из родителей и дыхательную компетентность, детерминируемую интактной мтДНК другого родителя. С общепринятой точки зрения такие клоны-цитодуктанты должны быть гомогенны, т.е. давать однородное митотическое потомство. Однако мы показали, что в отдельных скрещиваниях до 40% цитодуктантов оказываются потенциально гетерогенными, являясь скрытыми гетерокарионами. На созданной модели изучалась роль гена KAR1, кодирующего один из белков полу-моста полярного тельца веретена, на трансмиссию ядер в гетерокарионах дрожжей. Было показано, что в гетерокарионах, обладающих самым разным генетическим фоном, ядро, несущее мутацию kar1, попадает в первую почку, образованную гетерокариотической зиготой, реже, чем ядро с аллелью дикого типа - KAR1. Задержка деления, вызванная низкой температурой культивирования или отсутствием питательных веществ в среде, позволяла в ряде случаев спасти ядро, несущее рецессивную аллель kar1. Это говорит о том, что основным эффектом мутации kar1, проявляющемся при трансмиссии ядер в гетерокарионах, является замедление действия митотического веретена. Гибель ядер сопровождалась накоплением активных форм кислорода (АФК) и нарушениями в структуре ядер, выявляемой с помощью окраски DAPI и флуоресценцией белка слияния GFP-histone 2A, а также регистрацией разрывов в структуре ДНК в тесте TUNEL (terminal transferase-mediated dUTP nick end-labeling). Это позволяет считать наблюдаемую гибель ядер апоптозо-подобным процессом. Мы показали, что гибель, наблюдаемая как в генетических экспериментах, так и при помощи окраски TUNEL, часто затрагивает лишь одно ядро, а накопление АФК происходит достаточно часто лишь в половине гетерокариотической зиготы. Таким образом в некоторых случаях наблюдается уникальный фомен апоптозо-подобной гибели не целых клеток, а их частей. Нами были получены предварительные данные о том, что агент, изгоняющий ряд прионов из клетки (GuHCl), приводит к модификации трансмиссии родительских ядер в гетерокарионах.

Учитывая последний результат, мы предприняли систематическое исследование прионов дрожжей. Это является третьим, и на данный момент основным направлением работы группы. Мы начали с определения количества амилоидных структур в грубых экстрактах клеток дрожжей, используя окраску тиофлавином Т. Нами показано, что обработка GuHCl, приводящая к потере приона [PSI⁺], действительно снижает количество амилоидных структур в клетке. Цитодукция в большинстве, но не всех комбинациях реципиент/донор приводила к повышению оцениваемого нами количества амилоидов. Далее нами были получены штаммы дрожжей-сахаромицетов, в которых а) при помощи воздействия гуанидин-хлорида и вследствие сверхэкспрессии шаперона HSP104 были элиминированы некоторые прионизированные белки, б) благодаря сверхэкспрессии продукта гена SUP35 было увеличено количество одного из дрожжевых прионов - пси-фактора и в) методом цитодукции введена цитоплазма штаммов с иным составом прионов. У всех полученных штаммов анализировались осадки грубых лизатов. Белок Sup35p (способный к прионизации с генерацией цитоплазматически наследуемого [PSI⁺] фактора) использовался как маркер и был выявлен иммунохимически только в осадках [PSI⁺], но не [psi^-] культур. Используя цитодукцию, мы показали, что ряд анализируемых белков присутствует в цитоплазме штамма-донора, а также полученных цитодуктантов, но отсутствуют у реципиента. Идентификация белков, которые реагировали на прионотропные воздействия (сверхэкспрессию шаперона, обработку хлоридом гуанидина и цитодукцию) показала, что большинство из этих белков являются не прионами, а белками, ассоциированными с прионами. Этот результат подсказывает механизм трансмиссии при цитодукции соответствующих этим белкам электрофоретических полос. Согласно этому механизму трансмиссия прионизированного состояния нескольких белков приводит к тому, что ряд белков, способных взаимодействовать с прионами, мобилизуется в агрегаты вместе с ними (и формирует фракцию осадков, выделенную предложенным нами методом). Была проведена масс-спектрометрическая (MALDI) идентификация 38 белков, которые реагировали на прионотропные воздействия и более чем 40 белков, которые реагировали на присутствие в клетке дрожжей красного пигмента. Было выявлено множество шаперонов и ферментов, участвующих в гликолизе и ряд белков, участвующих в реакции клетки на окислительный стресс, а также в процессах протеолиза и трансляции. Состав найденных белков близок к набору, идентифицированному другими авторами, которые анализировали амилоидные агрегаты, но дополнительно обнаружен ряд белков, не в ыявленных ранее в составе прионовых агрегатов, к ним относятся в частности белки, участвующие в реакции на окислительный стресс. Выдвигается гипотеза, что степень агрегации найденных прион- и пигмент-зависимых белков повышается при увеличении количества амилоида в клетках дрожжей. Среди идентифицированных белков оказались два известных приона и несколько белков (Sod1p и Cus1p), которые, возможно, подвергаются амилоидизации в клетках дрожжей (несмотря на то, что они не принадлежат к NQ-богатым белкам как все известные дрожжевые прионы).

Наша группа постоянно сотрудничала с другими лабораториями, заинтересованными в модельных экспериментах на дрожжах.

Сойдла Т. Р., Лукина Н. И. (1998). Cтереоспецифические аномалии в структуре пяти полностью секвенированных хромосом дрожжей. Цитология 40 (7): 661-676.

Невзглядова О. В., Давыденко С. Г., Cмирнова Т. И., Сойдла.Т. Р. (1998). Скрытые гетерокарионы в штаммах Saccharomyces cerevisiae. Часть I. Псевдоплейотропная супрессия в множественно маркированном штамме YPH857. Генетика 34 (12), 1597-1602.

Невзглядова О. В., Давыденко С. Г., Cмирнова Т. И., Сойдла.Т. Р. (1998). Скрытые гетерокарионы в штаммах Saccharomyces cerevisiae. Часть II. Модельные опыты. Генетика 34 (12), 1603-1609.

Сойдла Т. Р., Лукина Н. И. (1999). Стереоспецифические аномалии в структуре ДНК IV, VII, VIII, X и XI хромосомы дрожжей-сахаромицетов. Цитология. 41 (6), 521-536.

Шмелев А. В., Корябин М. Ю., Давыденко.С.Г. (1999). С-концевой домен белка Chl4 дрожжей Saccharomyces cerevisiae связывается с фрагментом ДНК центромера хромосомы III. Цитология 41(8), 685-692.

Сойдла Т. Р., Лукина Н. И. (2000). Стереоспецифические аномалии в структуре ДНК V, XII, XIII, XIV, XV и XVI хромосомы дрожжей-сахаромицетов. Цитология 42 (8), 802-821.

Невзглядова О. В., Смирнова Т. И., Гайворонский А. А., Сойдла.Т. Р. (2000). Скрытые гетерокарионы в штаммах Saccharomyces cerevisiae. Условия проявления скрытого ядра. Генетика 36(8), 1017-1024.

Полиничко А. В., Давыденко С. Г., Чихиржина Е. В., Воробьев В. И. (2000) Образование компактных структур различных типов при взаимодействии негистонового хромосомного белка HMG1 с плазмидной ДНК. Цитология 42 (8), 787-793.

Невзглядова О. В., Гайворонский А. А., Артемов А. В., Смирнова Т. И., Сойдла.Т. Р. (2001). Выявление скрытых "незаконных" ядер при тетрадном анализе диплоидного потомства гетерокарионов у Saccharomyces cerevisiae. Генетика 37 (6), 754-761.

Невзглядова О. В., Гайворонский А. А., Артемов А. В., Сойдла.Т. Р. (2002). Факторы, влияющие на частоту скрытого гетерокариоза у Saccharomyces cerevisiae. Генетика 38 (3), 293-299.

Лукина Н. И., Сойдла Т. Р. (2002). Стереоспецифические аномалии в структуре ДНК 21-й хромосомы человека. Цитология 44, 585-591.

Nevzglyadova O. V., Artyomov A. V., Gaivoronskii A. A., & Soidla T. R. (2002). Concealed nuclei in Saccharomyces strains. (Review). FEMS Yeast Research 2 (4), 471-479.

Verkhusha V. V., Shavlovsky M.M., Nevzglyadova O.V., Gaivoronsky A.A., Artemov A.V., Stepanenko O.V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. (2003). Expression of recombinant GFP-actin fusion protein in the methylotropic yeast Pichia pastoris. FEMS Yeast Research 3(1), 105-111.

Лукина, Н. И., Сойдла Т. Р. (2004). Филогенетический анализ генов дрожжей, имеющих крупные стереоспецифические аномалии в промоторной области. Цитология 46 (3), 277-282.

Nevzglyadova O. V., Artyomov A. V., Mikhailova E.V., & Soidla T. R. (2004). The impact of manipulations with cytoplasmatically inherited factors on nuclear transmission and degradation in yeast heterokaryons. Current Genetics 45 (5), 273-282.

Davydenko S. G., Juselius J. K., Munder T., Bogengruber E., Jantti J., & Keranen S. (2004) Screening for novel essential genes of Saccharomyces cerevisiae involved in protein secretion. Yeast 21 (6), 463-471.

Davydenko S. G., Feng D., Jantti J., & Keranen S. (2005) Characterization of GPI14/YJ013w mutation that induces the cell wall integrity signaling pathway and results in increased protein production in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 22 (12), 993-1009.

Nevzglyadova O. V., Artyomov A. V., Mikhailova E.V., & Soidla T. R. (2005). Bud selection and apoptosis-like degradation of nuclei in yeast heterokaryons: a KAR1 effect. Mol. Gen. Genomics 274 (4), 419-427.

Невзглядова О.В., Артемов А.В., Зенин В.В., Верхуша В.В., Шавловский М.М., Поварова О.И., Степаненко О.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. (2007) Экспрессия рекомбинантного актина 5С из дрозофилы в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris. Цитология 49 (4), 300-309.

Невзглядова О.В., Кузнецова И.М., Артемов А.В., Михайлова Е.В., Туроверов К.К., Сойдла Т.Р. (2008) Сравнительная оценка содержания амилоида и прионов в клетках дрожжей. Цитология 50 (1), 40-48.

Nevzglyadova O.V., Artemov A.V., Mittenberg A.G., Solovyov K.V., Kostyleva E.I., Mikhailova E.V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Soidla T.R. (2009) Prion-associated proteins in yeast: comparative analysis of isogenic [PSI+] and [psi-] strains. Yeast 26 (11): 611-631.

Невзглядова О.В., Артемов А.В., Миттенберг А.Г., Костылева Е.И., Михайлова, Е.В., Соловьев К.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Сойдла Т.Р. (2010) Сравнительный анализ осадков грубых лизатов из клеток дрожжей, отличающихся своим прионовым составом: идентификация белков, ассоциированных с прионами. Цитология 52 (1): 63-79.

Невзглядова О.В., Артемов А.В., Миттенберг А.Г., Михайлова, Е.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Сойдла Т.Р. (2010) Влияние красного пигмента на амилоидизацию белков у дрожжей. Цитология 52 (1): 80-93.

Научные подразделения    Главная